Donostia Ospitalearen Immunologiako Zerbitzua

Zerbitzuko burua: Cuadrado doktorea Mediku adjuntua: Mª D. De Juan doktorea

A hemofilia

A hemofilia edo koagulazioaren VIII. faktorearen urritasuna (Fc VIII) gizakiek duten koagulopatiarik nagusienetakoa da, eta 10000 gizonezkoetatik batek du gutxi gorabehera. Gaitz honen herentzia errezesiboa da eta X kromosomari lotuta dago. Mutazioa gizonezkoetan zein emakumezkoetan azaltzen da eta kalkulatzen da kasu esporadikoen ama eramaileentzako proportzioa %85 ingurukoa dela. Halaber, kontuan hartu behar da eramaile konstituzionalak ez diren gainerako emakumezkoek duten mosaizismo germinalaren arriskua. Fc VIIIren molekula, modu ez kobalentean, von Willebrand Faktorea (Fc vW) deitutako glikoproteina multimeriko bati lotuta dago, zeinak hemostasiaren prozesuan Fc VIIIren jarduera egonkortzen eta kaltetutako ehunarengana garraiatzen duen. Fc VIIIren gabeziak edo murrizketak hemostasiaren ondorioak aldatzen ditu. A hemofiliaren larritasun klinikoa zuzenean dago erlazionatuta plasman dagoen Fc VIIIren konzentrazioarekin. Horregatik, %1aren azpiko mailak mota larriari lotuta daude, %2tik %5era bitarteko Fc VIIIren mailak dituzten gaixoek mota moderatua dute, eta %6tik %20ra bitarteko tasak dituztenek arazo arinak dituzte. Fc VIIIren murrizketa larria duten gaixoek artikulaziobarneko berezko odoljarioak izan ditzakete (hemartrosia) -batez ere belaunetan, orkatiletan, eskumuturretan, ukondoan eta aldaketan-, gaixoak tratatzen ez badira antropatia mailakatuak eraginez. Artikulaziobarneko odoljarioei muskulubarneko odoljarioak eta peritoneoatzeko odoljarioak eransten zaizkio. Lehen gaixotasun hilgarritzat jo arren, ordezko terapeutika (hemoderibatu plasmatikoak zein Fc VIII-Cren konzentratuak izan) aurrerapauso handia izan da bizi itxaropenaren eta kalitatearen arloan. Alabaina, tratamendu horrek gaixotasunak kutsatzeko arriskua ekarri zuen (hepatitisa eta IHESA, nabarmenenen artean) inaktibazio biralen metodoak eta VIII. faktorearen konzentratu errekonbinateak erabili arte. Gaur egun, Fc VIII-Cren kontrako inhibitzaileak dira arazo terapeutikorik handiena. A hemofiliaren kasuen gutxi gorabehera %15ak antigorputzak sortzen ditu (jarduera inhibitzailea) Fc VIIIren infusioaren aurrean. Historikoki, eramaileen detekzioa kalkulu bayesiarretan oinarritzen zen pedigreetik (genealogia-zuhaitzatik) eta Fc VIII aktiboaren, Fc von Willebranden eta coFc ristozetinaren tasetatik abiatuz. Analisi honek ahalbidetzen zuen %70etik %95era bitarteko eramaile potentzialen genotipo bat aurretik jakitea. Iraganean, jaio aurreko diagnostikoa –lehen fetoskopiaren bidez eta berriki funikulozentesiaren bidez lortutakoa– fetuaren plasman zeuden koagulazio-faktoreen neurrien baitan zegoen. Alabaina, Fc VIIIren genea identifikatzeak eramaileak detektatzeko eta jaio aurreko diagnostikoa egiteko ligamendu-analisia ahalbidetu du. -A hemofiliaren patologia molekularra Fc VIIIrentzat kodifikatzen duen genea 1984an klonatu eta bereizi zen. Ezagutzen den generik handiena dugu (186 Kb) eta bertan gertatzen diren mutazioak oso heterogeneoak direla ikusi zen. 1993an, A hemofilia larria duten familien gutxi gorabehera %45ari eragiten dion mutaziorik ohikoena identifikatu zen, 22. intronaren sekuentzien eta X kromosomaren telomeroaren beste sekuentzia batzuen arteko birkonbinazio homologo bat izanik. Birkonbinazio honek genearen 3' muturraren zati baten inbertsioa eta transkripzioa etetea dakar. Beste modu batean esanda, genea bi zatitan banatzen da, alderantziz eta 500 Kb inguruko tartearekin geratuz. Mutazioaren analisi zuzena egin daiteke inbertsio hauek detektatzeko. Inbertsiorik ez duten gaixoak ADN intra eta extragenikoen markatzaileekin aztertu egiten dira beste mutazio batzuk detektatzeko. Markatzaile hauekin egindako ligamendu-analisiak eramaileen egoera edo arriskuan dauden gizabanakoak fidagarritasun handiarekin diagnostikatzea ahalbidetzen du. -Eramaileen diagnostikoa eta aholkularitza genetikoa Analisia egiteko oharrak: A hemofiliaren historia familiarra duten emakumezkoentzat eramaileen diagnostikoa eta A hemofiliaren jaio aurreko diagnostikoa. Honako azterketak egiten dira: Mutazioaren analisi zuzena: Fc VIIIren genearen barruan inbertsioak identifikatzen dira, Southern bloten teknikaren bidez, 482.6 sonda eta Bcl I murrizketa-entzima erabiliz (gaur egun, PCR bidezko analisiak inbertsioa detektatzen du baina ez du bereizten distala edo hurbila den). Inbertsiorik gabeko gaixoak VIII. faktorearen genearen alde kodifikanteen anplifikazio selektiboaren, SSCPren eta sekuentziazioaren bidez aztertzen dira beste mutazio batzuk detektatzeko. Ligamendu-analisia: mutazio guztiak detektatzea ezinezkoa denez, Fc VIIIren genearen markatzaile intragenikoak eta extragenikoak erabiltzen dira gene akastunaren presentziaren zeharkako analisi egiteko. Erabilitako markatzaileek bi murrizketa-polimorfismo intrageniko dituzte (Bcl I/18. introna eta Xba I/22. introna), bi mikrosatelite (CA)n intrageniko (13. eta 22. introna) eta bi markatzaile extrageniko (St14 eta Dx13). Polimorfismo hauen detekzioa Southern bloten analisiaren edo PCR bidez egiten da. Azterketa egiteko hainbat senitartekoren laginak behar dira, gurasoak, aitona-amonak eta A hemofilia duten gaixoak, eta orobat eramaileak izan daitezkeenak barne. Erreferentziak: 1. www.sant pau.es… web-orria. 2. (Fedhemo 27. zk. 7-31 orr.); 3.Tizzano E., Domènech M., Altisent C., Tusell J., Baiget M: Inversions in the factor VIII gene in Spanish Hemophilia A patients. Blood 83:3826, 1994. 4.Tizzano E., Domènech M., Baiget M. Inversion of the intron 22 in isolated cases of hemophilia A. Thrombosis and Haemostasia 73:6-9 (1995). 5.Antonarakis SE et. al.: Factor VIII inversions in severe hemophilia A: Results of an International Consortium study. Blood, 86:2206-2212, 1995.

B hemofilia

B hemofilia K bitaminaren mende dagoen koagulazio-faktore baten –IX. faktorea (Fc IX)– defizitaren edo alterazioaren ondorio da. A hemofilian bezalaxe, X kromosomari lotuta transmititzen den herentziazko gaixotasuna da. Bere eragina A hemofilia baino txikiagoa da, gutxi gorabehera jaiotako 30.000 gizonezkoetatik batek izanik. Gaixotasun honen garrantzia kliniko-patologikoa, soziala eta ekonomikoa A hemofiliarekin aldera daiteke alderdi askotan. Hortaz, B hemofilia duten gaixoen odoljarioen adina IX. faktorearen maila plasmatikoekin dago lotuta. Horrela, %1etik beherako, %2tik %5era bitarteko eta “%5etik %30era bitarteko IX. faktorearen jarduerak, lotzen dira, oro har, bilakaera larri, moderatu eta arin batekin, hurrenez hurren. -B hemofiliaren patologia molekularra IX. faktorearen geneak 34 kb neurtzen du. B hemofiliaren adierazpen klinikoaren mekanismo molekular arduradunei dagokienez, A hemofiliarako emandako ohar asko B hemofiliari ere aplika dakizkioke. Alabaina, B hemofilian ez dago mutazioa maioritario bat A hemofiliaren 22. intronaren inbertsioan gertatzen den bezala. Egun Fc IXren genearen mutazioak ere heterogeneoak direla frogatu da, identifikatzeko lana zailduz. ADNaren markatzaileak B hemofiliak eragindako gaixoak dituzten familietan jario-eredu anomaloa aztertzeko erabil daitezke. Markatzaile hauek genearen barruan daude (intragenikoak) edo genetik hurbil, X kromosomaren q28 aldean (extragenikoak). Bi kasutan gene anomaloaren zeharkako analisia da. Baliteke familia batzuetan erabilitako ADNaren markatzaileen informatibitate falta egotea. Markatzaile intragenikoak edo genearen ondokoak erabiltzeak mutazioaren eta aztertutako polimorfismoaren edo polimorfismoen arteko birkonbinazioaren aukera txikiagotzen du. Hau dela eta, emaitzak oso fidagarriak dira baina probabilistikoak. - Eramaileen diagnostikoa eta aholkularitza genetikoa Analisia egiteko oharrak: B hemofiliaren historia familiarra duten emakumezkoentzat eramaileen diagnostikoa. Eta B hemofiliaren jaio aurreko diagnostikoa. Analisi zuzen bat egin daiteke: alde kodifikanteen anplifikazio selektiboa, SSCP eta sekuentziazioa egiten da mutazioak detektatzeko eta orobat ligamendu edo zeharkako analisi bat: Fc IXren genearen markatzaile intragenikoak eta extragenikoak erabiltzen dira gene hemofilikoaren presentziaren zeharkako analisia egiteko. Erabilitako markatzaileek bost polimorfismo intrageniko hartzen dituzte barne: DdeI 1. intronean; XmnI 3. intronean; TaqI 4. intronean; HhaI 3´ mutur flankeantean. Informatiboak ez diren kasuak bi mikrosatelite flankeante extragenikoekin aztertzen dira: 5´ 1192 (DXS102) eta 3´ 1205 (DXS105). Polimorfismo hauek PCRren analisiaren bidez detektatzen dira. Azterketa egiteko hainbat senitartekoren laginak behar dira, gurasoak, aitona-amonak eta B hemofilia duten gaixoak, eta orobat eramaileak izan daitezkeenak barne. Erreferentziak: 1. www.sant pau.es…web-orria. 2.Peak IR, Lillicrap DP, Boulyjenkov V, Briët E, Chan V, Ginter EK, Kraus EM, Ljung R, Manucci PM, Nicolaides K, Tuddenham GD. Report of a joint WHO/WFH meeting on the control of haemophilia: carrier detection and prenatal diagnosis. Blood Coagulation and Fibrinolysis, 4:313-344,1993. 3.Gianelli F. eta Green P. The molecular basis of haemophilia A and B. Baillière´s Clinical Hematology, 9:211-228, 1996. 4.Montejo JM, Magallón M, Tizzano E, Solera J. Identification of twenty-one new mutations in the factor IX gene by SSCP analysis. Human Mutation 13:160-165, 1999.

Santa Creu eta Sant Pau Ospitaleko Genetikako Zerbitzuak hemofiliari buruz egindako azterketa genetikoak (Bartzelona)

Sant Pau Ospitaleko Genetikako laborategia erreferentzia-zentroa da gure herrian A eta B hemofiliaren azterketa molekularrarentzat. Talde honek DUQUESA DE SORIA saria jaso du 1999-2000 deialdian honako lanarengatik: “PATOLOGIA MOLECULAR DEL GEN DEL FACTOR VIII: SU RELACIÓN CON EL DESARROLLO DE INHIBIDORES, SU APLICACIÓN AL ASESORAMIENTO GENÉTICO Y SU IMPORTANCIA PARA LAS NUEVAS ALTERNATIVAS TERAPEUTICAS”. (Fedhemo 27. zk) Talde honetako kideek 305 familia aztertu dituzte (163 A Hemofilia familiarrarekin eta 142 kasu esporadiko batekin), HFko 197 kasu larri; 64 moderatu eta 44 arin. VIII. faktorearen mutazioa 133 gaixotan detektatu zen, familia horietan mutazioa aztertu zen 99 eramaile behartuetan eta eramaile izateko arriskua zuten 282 emakumezkoetan mutazioa zegoen ala ez jakiteko. 15 familiatan ez zen aztertzeko moduko gaixorik aurkitu eta horien amak aztertu ziren. Familiak hiru taldetan banatu ziren: 58 kasu familiar (gaixo bat baino gehiago bi belaunalditan), mosaizismoko 8 kasu posible (gaixo bat baino gehiago anai-arreben edota neba-ahizpen belaunaldi batean baina bestelako gaixorik gabe familian) eta 67 kasu esporadiko. Zuzenean nahiz zeharka aztertutako kasu guztien diagnostiko molekularra honako taulan labur daiteke:( I.taula (Fedhemo 27. zk. 7-31 orr.). Eramaileen, kasu familiarren eta kasu esporadikoen azterketak ondorengo taulan azaltzen dira: (IV. taula (Fedhemo 27. zk. 7-31 orr.). A hemofiliaren jaio aurreko diagnostikoa. Mutazioak detektatzeak A hemofiliaren 38 emakumezko eramaileen jaio aurreko diagnostikoa ahalbidetu zuen. Horietako emakume batzuek behin baino gehiagotan eskatu zuten diagnostikoa. Kasu guztietan polimorfismoak (zeharkako analisia) azterketa zuzenarekin jarri ziren korrelazioan. Laborategi honek egindako lanaren ondorioek gaixotasun honen azterketa molekularraren estrategia nolakoa den erakusteaz gain, aztertutako kasu-kopurua dela-eta itxaropen errealak fidagarritasun handiarekin ezagutzeko aukera ematen digute. Ondorioak (29. or. Fedhemo 27. zk. 7-31 orr.).

I eta IV taulak

Donostia Ospitaleak hemofilikoei eta senitartekoei egindako azterketa genetikoak

Immunologiako zerbitzua, Biologia molekularraren sailean (de Juan doktorea), HEMATOLOGIAKO zerbitzuarekin (Maite Uranga doktorea), aritzen da elkarlanean, A eta B hemofilia duten gaixoen, eramaileen eta senitartekoen azterketa genetikoa bideratzeko laguntza teknikoa emanaz. Hortaz, familien genealogia-zuhaitzak egin eta kasu bakoitzean aztertu behar diren eramaileen eta senitartekoen kasuak definitzen ditu, laginak prozesatuz eta Sant Pau Ospitaleko genetikako zerbitzura bidaliz, han aztertu ditzaten. Halaber, diagnostikoaren prozesu guztian hizketakide dira. Lankidetza hau dagonetik, hauxe da 1997tik gutxi gorabehera aztertu dena: A Hemofilia duten 12 familia: horietatik 6 kasu familiarrak eta 6 kasu esporadikoak dira; 4 kasutan A hemofilia larria zen; 3 kasutan moderatua eta 5 kasutan arina. Guztira 12 gaixo aztertu ziren; 13 eramaile behartu eta eramaile izateko arriskua zuten 38 gaixo. 10/12 familiatan azterketa informatiboa izan da, gainerako batean egiteke dago oraindik. Hauxe da azterketa molekularrean aurkitu dena: 22. intronaren inbertsio bat; VIII. faktorearen genearen 3 mutazio bereiztu dira. Haurdunaldian eramailearen diagnostiko bat eta jaio aurreko diagnostiko bat egin da. Bestalde, B Hemofilia duten 3 familia aztertu dira, bi esporadikoak eta kasu familiar bat guztira 4 gaixorekin; 3 eramaile behartu eta eramaile izateko arriskua zuten 12 gaixo. Azterketa informatiboa izan da 3 kasutan. Jaio aurreko diagnostiko bat egin da.